Western blotting ECL發(fā)光法檢測(cè)試劑盒

試劑盒內(nèi)容：
1. 封閉試劑：30g(可配制400ml)脫脂奶粉及其他蛋白，緩沖鹽等混合物。
2. 10倍濃縮抗體稀釋液，50ml。
3. HRP標(biāo)記二抗，0.1ml，效價(jià)1：2000-5000。
4. ECL顯色液，25mlA+25mlB。

試劑盒原理：
SDS-PAGE電泳后，蛋白質(zhì)按照分子量大小分離，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）后，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，加入發(fā)光底物后，能讓膠片感光。zui后經(jīng)顯影和定影后，可以在膠片上顯示出條帶來（抗原所在位置）。 

操作步驟：
常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜后，
1. 清洗轉(zhuǎn)印膜：將膜剝離下后，作好標(biāo)記，一般在左上角剪一缺口。室溫用TBS-T漂洗3次每次5min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。
2. 按5g封閉試劑加100ml雙蒸水計(jì)，配制膜封閉液，配好的膜封閉液為乳白色懸液，將漂洗過的轉(zhuǎn)印膜，封閉液內(nèi)，搖床震動(dòng)，室溫封閉30min。用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次5min。
3. 將10×抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成1×（10ml  10×抗體稀釋液加入90ml雙蒸水，混勻，可4℃保存三個(gè)月）。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。
4. 用1×的抗體稀釋液稀釋抗體。根據(jù)用量以及一抗的推薦稀釋濃度來稀釋一抗。將雜交膜放入雜交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育過ye或37℃搖動(dòng)孵育2h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步將膜沿電泳方向剪成條，分別作好標(biāo)記，分開孵育。
5. 用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次5min。
6. 用稀釋好的抗體稀釋液稀釋二抗。根據(jù)用量，按10ml抗體稀釋液加入5ulHRP標(biāo)記二抗的比例，配制二抗工作液。將雜交膜放入雜交袋中，加入二抗工作液，封口， 37℃搖動(dòng)孵育1h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。
7. 用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次10min。
8. 配制ECL發(fā)光液：根據(jù)用量，取ECL發(fā)光液A、ECL發(fā)光液B各等量，混勻，加在膜正面，暗室顯色5分種。先傾去顯色液，再小心用紙吸去顯色液，在上面蓋一層平整的透明紙。再取出感光膠片，做好標(biāo)記，輕輕的放在膜上，請(qǐng)小心不要錯(cuò)動(dòng)（余下的膠片請(qǐng)收好）。顯色30S到1分種，取出（直接上抬）膠片立即*浸入顯影液中1-2min，再丟入定影液中1分鐘，離開暗室，觀察結(jié)果，根據(jù)條帶強(qiáng)弱，可再次感光一次，并且減短或者加長(zhǎng)感光時(shí)間（從5秒到30分鐘）以期達(dá)到理想結(jié)果。 

注意事項(xiàng)：
1. 請(qǐng)根據(jù)一抗來源選擇試劑盒。而不是標(biāo)本來源來洗擇。因?yàn)槎故桥c一抗反應(yīng)而不是與標(biāo)本反應(yīng)。
2. western blotting ECL發(fā)光法操作比較煩瑣，但其敏感性較高，對(duì)于低豐度蛋白也能顯示出結(jié)果。
3.可以根據(jù)顯色結(jié)果來優(yōu)化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間。如背景過深，可延長(zhǎng)膜封閉時(shí)間，加長(zhǎng)zui終漂洗次數(shù)與時(shí)間。如果條帶過弱，可增加抗體濃度，延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間，加長(zhǎng)感光時(shí)間。
4. TBS-T（0.01M）配制方法：稱取NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用800ml的雙蒸水溶解，用鹽酸調(diào)PH到7.6，再加入0.5ml Tween－20，用雙蒸水 加至1000ml，混勻即可。（也可按照自己的配制習(xí)慣來配制）
如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果無條帶，可將稀釋過的一抗再作1倍，10倍，50倍稀釋，直接點(diǎn)到膜上（10ul），封閉，加二抗，zui后顯色，如果能顯出斑點(diǎn)來，則證明顯色系統(tǒng)沒有問題，可從蛋白裂解和一抗上面找原因；如果無法顯出，請(qǐng)先從顯色系統(tǒng)尋找原因。